Analisis Kuantitatif Zat Aditif (Vitamin C, Kafein Dan Na-Benzoat) dalam Sampel Minuman Hemaviton Energi dengan Instrumen HPLC

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA INSTRUMEN

Analisis Kuantitatif  Zat Aditif (Vitamin C, Kafein Dan Na-Benzoat) dalam Sampel Minuman Hemaviton Energi dengan Instrumen HPLC

Tanggal Praktikum : 21 April  2014

Dosen Pembimbing:

Soja Siti Fatimah, S.Si, M.Si.

Disusun Oleh:

Kelompok 2

Anis Ro’iyatunisa       (1103104)

Artha Lia Emilda        (1100317)

Aulia Rahim                (1100085)

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

2014

A.  Tanggal Praktikum : 21 April 2014

B.  Judul Praktikum

Analisis Kuantitatif  Zat Aditif (Vitamin C, Kafein dan Na-Benzoat) dalam Sampel Minuman Hemaviton Energi dengan Instrumen HPLC

C. Tujuan Percobaan

1. Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif

2. Melakukan preparasi dengan tepat dan akurat serta dapat mengikuti manual pengoperasian instrumen HPLC

3. Menentukan kadar zat aditif (Vitamin C, Kafein dan Na-Benzoat) dalam sampel minuman hemaviton energi.

D. Tinjauan Pustaka

       HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau bisa disebut juga dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan awal tahun 1970an. HPLC merupakan perangkat peralatan yang penting dalam perkembangan dunia analisis bahan baku maupun bahan pencemar. Fungsi utama HPLC pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya ditentukan oleh ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan produk kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak terlalu tinggi.

            HPLC merupakan teknik pemisahan yang secara luas digunakan dalam pemisahan dan pemurnian sampel di berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan minuman, industri polimer, dan berbagai bahan baku. Secara umum HPLC digunakan dalam kondisi-kondisi berikut :

a. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik.

b. Analisis ketidakmurnian.

c. Analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap.

d. Penelitian molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion.

e. Isolasi dan pemurnian senyawa

f. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip dan dalam jumlah kecil.

Instrumen pada HPLC terdiri dari wadah fasa gerak, fasa gerak, pompa, tempat injeksi, kolom, fasa diam, detektor, dan perangkat pendukung lainnya.

1. Wadah Fasa Gerak

Wadah fasa gerak dalam HPLC harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert. Wadah pelarut kosong atau labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fasa gerak. Wadah inert biasanya menampung fasa gerak antara 1-2 liter pelarut. Sebelum digunakan, wadah fasa gerak harus dibebasgaskan karena adanya gas akan menimbulkan gelembung gas pada pompa dan detektor yang akan mengacaukan hasil analisis.

 

 Gambar 1. Tempat fasa gerak dalam instrumen HPLC

2. Fasa Gerak

            Fasa gerak dalam HPLC harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan tingkat kemurnian yang tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat HPLC. Adanya pengotor dalam fasa gerak akan menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Partikel-partikel kecil yang terdapat dalam fasa gerak yang kurang murni dapat mengakibatkan kekosongan kolom HPLC.

            Fasa gerak atau dikenal juga denga istilah eluen umumnya merupakan campuran pelarut yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan resolusi HPLC ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fasa diam, dan sifat-sifat komponen dalam sampel. Secara umum ada dua tipe fasa gerak, yaitu :

a. Fasa gerak (eluen isokratik), yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah selama percobaan kromatografi.

b. Fasa gerak (eluen gradien), yaitu fasa gerak dengan komposisi pelarut yang berubah selama percobaan kromatografi.

            Berdasarkan kepolaran fasa gerak dibandingkan fasa diamnya, fasa gerak dibedakan menjadi :

a. Fasa normal, yaitu fasa diam lebih polar dari fasa gerak. Kemampuan elusinya akan meningkat seiring peningkatan polaritas.

b. Fasa terbalik, yaitu fasa diam kurang polar dari fasa gerak. Kemampuan elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fasa geraknya.

            Dalam HPLC fasa terbalik, fasa gerak yang paling sering digunakan adalah campuran larutan buffer-metanol atau campuran air-asetonitril. Sedangkan dalam fasa normal, sering digunakan campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi atau menggunakan pelarut jenis-jenis alkohol.

3. Pompa

            Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat seperti syarat wadah pelarut yaitu pompa harus inert terhadap fasa gerak. Bahan yang dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000Psi. Dan mampu mengalirkan fasa gerak dengan kecepatan alir 3ml/menit. Untuk keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fasa gerak dengan kecepatan alir 20ml/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantar fasa gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fasa gerak berlangsung secara tepat, reproduksibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa dalam HPLC, yaitu :

a. Pompa dengan tekanan konstan

b. Pompa dengan aliran fasa gerak yang konstan

Tipe pompa dengan aliran fasa gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

Gambar 2. Skema pompa instrumen HPLC

Gambar 3. Pompa dalam instrumen HPLC

4. Tempat Injeksi

            Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fasa gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup yang dilengkapi dengan keluk sampel internal dan eksternal.

 

 

Gambar 4. Posisi saat memuat sampel	Gambar 5. Posisi saat menyuntikkan sampel

5. Kolom

            Kolom merupakan bagian HPLC yang merupakan tempat fasa diam untuk berlangsungnya proses pemisahan sampel. Ada dua jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Dalam beberapa hal, kolom mikrobor lebih menguntungkan:

a. Konsumsi fasa gerak kolom mokrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fasa gerak lebih lambat (50-100 mL/menit)

b. Adanya aliran fasa gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobar lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

c. Sensitivitas kolom mikrobar ditingkatkan karena sampel lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas.

            Dalam prakteknya, kolom mikrobar tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

6. Fasa Diam

Sebagian besar fasa diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi. Silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stirena dan divinil benzena. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus fungsional lain. Oktadesil silika (ODS atau C₁₈) merupakan fasa diam yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi sesuai untuk sampel yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retendi yang bervariasi disebabkan adanya kandungan air yang terkandung didalamnya.

7. Detektor

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu :

a. Detektor universal, yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif. Contohnya detektor indeks biasdan detektor spektrometri massa.

b. Detektor yang spesifik, yang hanya akan mendeteksi sampel secara spesifik dan selektif. Seperti detektor UV-VIS, detektor flouresensi, dan detektor elektrokimia.

            Detektor yang ideal memiliki karakteristik sebagai berikut :

a. Mempunyai respon terhadap sampel yang cepat dan reproduksibel.

b. Mempunyai sensitivitas tinggi, yaitu mendeteksi sampel pada kadar sangat kecil

c. Stabil dalam pengoperasiannya

d. Mempunyai sel volume yang kecil, sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.

e. Sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi sampel pada kisaran yang kuat.

f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak.

                                                          Gambar 6. Detektor UV-VIS

Detektor	Sensitivitas (g/mL)	Kisaran Linier	Karakteristik
Absorbansi UV-VIS fotometer filter	5x10-10	104	Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus-gugus, dan struktur-struktur yang tidak jenuh.
Spektrofotometer	5x10-10	105
Spektrometer photo-diode array	>2x10-10	105
Flouresensi	104	104	Sensitivitas sangat bagus, selektif, tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak.
Indeks bias	5x10-7	104	Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien.
Elektrokimia Konduktimetri Amperometri	10-8 10-12	104 105	Peka terhadap suhu dan kecepatan alir fasa gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. Sensitivitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda.

8. Perangkat Pendukung

Perangkat pendukung yang digunakan dalam HPLC dapat berupa komputer. integrator, dan rekorder.

Gambar 7. Skema alat HPLC

Derivatisasi pada HPLC melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu sampel dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika dan kimia suatu sampel. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk :

a. Mengubah struktur molekul atau polaritas sampel sehingga menghasilkan puncak yang lebih baik.

b. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang baik

c. Menstabilkan sampel yang sensitif

            Suatu reaksi derivatisasi harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut :

1)   Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar UV maupun sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berflouresen sehingga dapat dideteksi dengan spektroflourometri.

2)   Proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100%)

3)   Produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi.

4)   Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan.

Zat aditif pada makanan dan minuman adalah zat-zat yang ditambahkan selama proses produksi, pengemasan, atau penyimpanan agar mutu dan kestabilan makanan dan minuman tetap terjaga dan untuk mempertahankan nilai gizi yang mungkin rusak atau hilang selama proses pengolahan. Pada awalnya zat aditif tersebut berasal dari tumbuhan yang disebut zat aditif alami. Umumnya zata ditif alami tidak menimbulkan efek samping yang membahayakan kesehatan manusia. Akan tetapi, jumlah penduduk bumi semakin banyak menuntut jumlah makanan dan minuman yang lebih besar sehingga zataditif alami tidak mencukupi lagi. Oleh karena itu, industri makanan dan minuman yang memakai zat aditif buatan (sintesis). Bahan baku pembuatannya adalah dari zat-zat kimia yang kemudian direaksikan. Zat aditif sintesis yang berlebihan dapat menimbulkan beberapa efek samping.

       Terdapat berbagai zat aditif yang digunakan oleh produsen makanan dan minuman seperti natrium benzoat, vitamin C, dan kafein untuk masing-masing tujuan tertentu. Ketiga zat aditif tersebut merupakan senyawa yang memiliki sifat kepolaran yang berbeda dan memiliki gugus kromofor yang menyebabkan senyawa tersebut dapat menyerap sinar UV. Berdasarkan karakteristik senyawa ini memungkinkan dilakukannya analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar.

E. Alat dan Bahan

# Alat

1)   Perangkat HPLC                     1 set

2)   Neraca analitik                        1 set

3)   Spatula                                                1 buah

4)   Labu ukur 10mL                     6 buah

5)   Labu ukur 50mL                     1 buah

6)   Corong pendek                        1 buah

7)   Pipet tetes                                2 buah

8)   Gelas kimia 20mL                   1 buah

9)   Gelas kimia 500mL                 1 buah

10)    Ultra sonic vibrator               1 set

11)    Pipet volum (1-5 mL)           masing-masing 1 buah

12)    Botol vial                             11 buah                      

# Bahan

1)   Natrium Benzoat (p.a)             10 mg

2)   Kafein                                     10 mg

3)   Vitamin C standar                   5 mg

4)   Metanol                                   280 mL

5)   Aquabides                               120 mL

6)   Sampel minuman                     2 mL

7)   Membran PTFE                       2 buah

F. Prosedur Kerja Praktikum

1) Pembuatan Fasa Gerak

Aquabides diambil sebanyak 120 mL, dimasukkan kedalam gelas kimia 500 mL. Dicampurkan dengan etanol sebanyak 280 ml. Perbandingan aquabides dan etanol 30% : 70%.

2)      Pembuatan Larutan Induk

Larutan induk dibuat dari campuran Na-benzoat, vitamin C dan kafein. Pertama, Na-benzoat ditimbang sebanyak 10 mg, vitamin C sebanyak 5 mg, dan kafein sebanyak 10 mg. Ketiga zat tersebut dilarutkan dengan fasa gerak menggunakan labu ukur 50 mL. Larutan ditanda bataskan hingga volume 50 mL. Larutan induk kemudian dihomogenkan menggunakan ultrasonic vibrator selama ± 5 menit.

3)      Pembuatan Deret Larutan Standar

Pembuatan larutan standar, dibuat dengan cara mengencerkan larutan induk dengan fasa gerak. Larutan induk dipipet sebanyak 1mL, 2mL, 3mL, 4mL, 5mL dan 6mL, masing-masing dimasukkan kedalam labu ukur 10mL. Kemudian ditandabataskan menggunakan fasa gerak hingga volummenya 10mL. Larutan standar kemudian disaring dengan membran PTFE. Hasil penyaringan ditampung dalam botol vial kering yang telah dioven. Selanjutnya dilakukan penghilangan gelembung dengan cara  degassing.

4)      Preparasi Sampel

Dalam preparasi sampel, sampel dipipet sebanyak 2mL. Sampel dilarutkan dengan fasa gerak dan ditandabataskan dalam labu ukur 10mL. Kemudian disaring mengunakan membran PTFE dan hasil penyaringan disimpan dalam botol vial kering. Selanjutnya dilakukan degassing menggunakan ultrasonic vibratori.

5)      Penyiapan Instrumen HPLC dan Pengujian sampel

Instrumen HPLC, dipastikan semua kabel penghubung telah terhubung dengan sumber listrik. Semua tombol “ON” pada alat HPLC dinyalakan. Botol fasa gerak diisi dengan fasa gerak dengan volume memadai. Botol pembuangan dikosongkan. Fasa gerak dikondensasikan dengan sistem isokratik dengan perbandingan 60 : 40, Metanol : aquabides. Dilakukan pemrograman alat HPLC (pilihan mode yang akan digunakan disesuaikan dengan parameter yang akan digunakan ketika pengukuran).

Parameter
Kolom	C-18 (12,5 cm)
Laju Alir	0,75 mL/menit
Volum injeksi	20 μL
ʎ	254 nm

 Alat HPLC didiamakan hingga muncul base line dan sampel siap diinjeksikan.

Ketika kromatogram pada layar komputer telah menunjukkan base line mendatar dan alat siap digunakan. Tahap injeksi dimulai dengan menginjeksikan larutan standar dari konsentrasi rendah hingga tertinggi. Cara penginjeksian dilakukan dengan menggunakan siring dengan sistem stop-flow. Setelah semua larutan standar selesai diinjeksikan kemudian sampel diinjeksikan. Hasil kromatogram diprint. Setelah semua pengukuran selesai alat HPLC dioffkan kembali.

 

G. Hasil dan Analisis Data

Dalam percobaan ini dilakukan kadar zat aditif (vitamin C, kafein, dan natrium benzoat) dalam sampel hemaviton energi dengan menggunakan instrumen HPLC. Prinsip dasar dari HPLC adalah perbedaan distribusi komponen pada sampel diantara fasa gerak cair dan fasa diam cair. Dalam percobaan ini, fasa gerak yang digunakan adalah campuran antara metnol dan aquadbidest dengan perbandingan 60 : 40. Namun, dalam preparasi sampel, fasa gerak yang dibuat adalah campuran antara metanol dan aquabidest dengan perbandingan 70 : 30. Hal ini dilakukan karena berharap pemisahan yang dihasilkan optimal (dapat terpisah ketiga komponennya). Sedangkan, fasa diam yang digunakan adalah C18 yang bersifat nonpolar, sehingga pada percobaan ini digunakan metode HPLC fasa terbalik, yaitu fasa geraknya polar dan fasa diamnya nonpolar dengan sistem isokratik yaitu hanya menggunakan satu kondisi perbandingan fasa gerak 60:40 (dibuat tetap), dan laju alirnya 0,75 mL/menit.

Dalam preparasi sampel, sampel yang digunakan adalah hemaviton energi sebanyak 2 Ml yang kemudian di encerkan dengan fasa gerak sampai volumenya 10 ml yang kemudian disaring dulu menggunakan membran PTFE supaya pengotor tidak ikut terukur dan kemudian di degassing dengan menggunakan ultrasonic vibrator supaya campuran menjadi homogen sebelum dilakukan pengukuran dengan instrumen HPLC.

Analisis yang dilakukan dalam percobaan ini adalah analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan waktu retensi standar. Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan sampel untuk keluar kolom, dimana dari kromatogram deret standar, dapat dianalisis puncak yang pertama keluar (waktu retensi kecil) adalah diduga vitamin C, puncak kedua diduga kafein, dan puncak ke tiga diduga natrium benzoat. Hal ini didasarkan karena tingkat kepolaran dari ketiga senyawa tersebut, dimana tingkat kepolarannya adalah vitamin C > kafein > natrium benzoat. Karena fasa diamnya yang bersifat nonpolar, sehingga yang memiliki kepolaran rendah akan lebih lama berada di dalam kolom, sedangkan yang memiliki kepolaran tinggi akan cepat keluar dari kolom (waktu retensi kecil). Namun, pada saat pengukuran deret standar untuk konsentrasi rendah, masih belum terpisah antara puncak satu dengan puncak dua. Hal ini menunjukkan bahwa pemisahan yang dilakukan masih kurang optimal, sehingga dari waktu retensi standar, dapat diketahui kandungan vitamin C, kafein,dan natrium benzoat sampel dilihat dari kedekatan waktu retensi standarnya.

Sedangkan, analisis kuantitatif dilakukan dengan menghitung konsentrasi sampel berdasarkan luas area puncak kromatogram dengan menggunakan metode kurva kalibrasi dari larutan deret standar. Larutan deret standar dibuat dan diukur sebanyak dua kali, yaitu deret yang pertama dibuat dengan menggunakan pipet seukuran untuk mengambil larutan induknya, sedangkan deret kedua menggunakan pipet ukur untuk mengambil larutan induknya. Hal ini dilakukan karena ada sedikit kesalahan dari praktikan.

Dari pembuatan deret standar sebanyak dua kali, dapat dibandingkan konsentrasi dan kadar dari komponen pada sampel. Untuk luas area komponen pada sampel yang berasa pada rentang luas area deret standar, dilakukan perhitungan konsentrasi dengan menggunakan persamaan garis y = mx + b, sedangkan jika tidak berada pada rentang luas area deret standar, dilakukan perhitungan konsentrasi dengan menggunakan perbandingan konsentrasi dan luas area sampel dan standar.

Dari hasil peritungan, dapat diperoleh hasil sebagai berikut :

Diduga zat yang terkandung	Konsentrasi (ppm)		Kadar (mg)
	Deret 1	Deret 2	Deret 1	Deret 2
Vitamin C	58.2624	73.3853	43.6968	55.0389
Kafein	41.3966	37.7252	31.0475	28.2939
Natrium benzoat	220.8138	228.0471	220.8138	171.0353

 H. Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengukuran dengan instrumen HPLC untuk sampel minuman hemaviton energi diperoleh kadar vitamin C, Kafein, dan natrium benzoat dengan menggunakan deret standar pertama secara berturut-turut adalah 43.6968 mg ; 31.0475 mg ; dan 220.8138 mg dalam 150 mL sampel. Sedangkan kadar vitamin C, kafein, dan natrium benzoat dengan menggunakan deret standar kedua secara berturut-turut adalah 55.0389 mg ; 28.2939 mg ; dan 171.0353 mg dalam 150 mL sampel.

DAFTAR PUSTAKA

Hendayana, S, (1994). Kimia Analitik Instrumen. Semarang : IKIP Semarang Press.

Hendayana, S, (2006). Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung : PT Remaja Rosdakarya.

Skoog, Douglas. A. (2004). Fundamentals of Analytical Chemistry Eighth Edition. Brooks/Cole : Canada

Tim Kimia Analitik Instrumen. (2011). Penuntun Praktikum Kimia Ananlitik Instrumen (KI 431). Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.